Sumber Aneka Karya Abadi - Your trusted partner for laboratory instrument

Faktor apa yang dapat menyebabkan kerusakan pada Dairy Product (Produk Olahan Susu)? Salah satu faktor yang dapat menyebabkan kerusakan pada dairy product adalah pertumbuhan dan aktivitas mikroba terutama bakteri, ragi, dan kapang. Beberapa mikroba dapat membentuk lendir, gas, busa, warna yang menyimpang, asam, racun dan lain-lain yang menunjukkan kerusakan pada dairy product. Untuk itu, bagaimana cara untuk memastikan atau menguji apakah dairy product yang diproduksi bebas dari mikroba? Metode pengujian yang tepat telah ditentukan dalam Standar Nasional Indonesia (SNI) 2897:2008, yaitu dengan pengujian Total Plate Count (TPC), pengujian Most Probable Number (MPN) Coliform, pengujian MPN Escherichia coli, pengujian jumlah Staphylococcus aureus, pengujian Salmonella spp., pengujian Campylobacter spp., dan pengujian Listeria monocyptogenes.

Dairy product merupakan bahan makanan yang berbasis susu atau terbuat dari hasil olahan susu, termasuk susu itu sendiri, cream, butter, keju, yogurt, kefir, es krim, custard, dan produk-produk olahan lainnya turunan susu lainnya seperti permen, selai, sereal, pancake, waffle, dan lainnya. Sedangkan susu itu sendiri adalah cairan yang berasal dari ambing ternak perah sehat dan bersih, yang diperoleh dengan cara pemerahan yang benar sesuai ketentuan yang berlaku, yang kandungan alaminya tidak dikurangi atau ditambah sesuatu apapun dan belum mendapat perlakuan apapun kecuali proses pendinginan [1].

Bagaimana cara pengujian mikroba pada dairy product?

Cemaran mikroba merupakan salah satu faktor yang penting dalam menentukan kualitas dairy product. Sehingga perlu untuk melakukan monitoring cemaran mikroba. Adapun cara pengujian cemaran mikroba pada dairy product seperti yang telah disebutkan diatas adalah sebagai berikut [1].

1. Pengujian Total Plate Count (TPC)

Pengujian Total Plate Count (TPC) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikroba yang terdapat dalam dairy product dengan cara menghitung koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media agar.

Pengujiian TPC diawali dengan dibuatkan pengenceran dengan menggunakan Buffered Pepton Water (BPW) 0,1%. Kemudian suspensi dari setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri secara duplo dan ditambahkan Plate Count Agar (PCA), dan didiamkan sampai menjadi padat. Setelah itu, diinkubasikan pada temperatur 32 ⁰C ± 1 ⁰C selama 24 - 48 jam (dapat dilihat pada Gambar 1. dibawah ini).

 

Gambar 1. Langkah-langkah pengujian TPC: preparasi sampel (pengenceran), pengayaan, dan peneguhan

Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah koloni dengan menghitung jumlah koloni dengan memilih cawan yang mempunyai jumlah koloni 25 sampai dengan 250. Interpretasi hasil dilakukan dengan melihat cawan dengan jumlah koloni kurang dari 25, cawan dengan jumlah koloni lebih dari 250, koloni yang menyebar (spreaders), dan cawan tanpa koloni.

 

2.  Pengujian Most Probable Number (MPN) Coliform dan Eschericia coli

Pengujian Most Probable Number (MPN) terdiri dari uji presumtif (penduga) dan uji konfirmasi (peneguhan), dengan menggunakan media cair di dalam tabung reaksi dan dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya gas di dalam tabung Durham.

Pengujian Most Probable Number (MPN) Coliform dan Eschericia coli diawali dengan membuat pengenceran seperti pada pengujian TPC. Uji pendugaan Coliform dan E. coli menggunakan Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB) dan uji peneguhan Coliform menggunakan Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB). Sedangkan uji pendugaan E. coli menggunakan Escherichia Coli Broth (ECB). Langkah-langkah pengujian pendugaan dan peneguhan Coliform dan E. coli disajikan dalam Gambar 2 skema dibawah ini.

 

Gambar 2. Skema langkah-langkah pengujian pendugaan dan peneguhan Coliform dan E. coli

Banyaknya Coliform yang terdapat dalam sampel uji diinterpretasikan dengan mencocokkan kombinasi jumlah tabung yang memperlihatkan hasil positif, berdasarkan tabel nilai MPN Kombinasi yang diambil, dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif, sedangkan pada pengenceran berikutnya terdapat tabung yang negatif. Kombinasi yang diambil terdiri dari tiga pengenceran. Nilai MPN sampel dihitung dengan rumus:

Pada pengujian E. coli, dilanjutkan dengan isolasi-identifikasi melalui uji biokimia Indole, Methyl red, Voges-Proskauer dan Citrate (IMViC). Uji isolasi – identifikasi yaitu dibuat goresan pada media Levine Eosin Methylene Blue Agar (L-EMBA) atau Violet Red Bile Agar (VRBA) dari tabung ECB yang positif, inkubasi pada temperatur 35 °C selama 18 jam sampai dengan 24 jam. Koloni yang diduga E. coli berdiameter 2 mm sampai dengan 3 mm, warna hitam atau gelap pada bagian pusat koloni, dengan atau tanpa metalik kehijauan yang mengkilat pada media L-EMBA. Ambil koloni yang diduga dari masing-masing media L-EMBA dengan menggunakan ose, dan pindahkan ke PCA miring. Inkubasikan PCA miring pada temperatur 35 °C selama 18 jam sampai dengan 24 jam untuk uji biokimia.

Uji biokimia untuk E. coli dengan uji IMViC – uji produksi indole yaitu dengan cara menginokulasikan koloni dari tabung PCA pada Tryptose Broth (TB) dan inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam dan ditambahkan reagen Kovac. Hasil reaksi positif ditandai dengan adanya bentuk cincin merah pada lapisan atas media, sedangkan hasil reaksi negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Selanjutnya, uji biokimia dengan uji IMViC – Uji Voges-Proskauer (VP): Ambil biakan dari media PCA lalu diinokulasikan ke tabung yang berisi media Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP) dan diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 48 jam ± 2 jam. Kemudian pindahkan MR-VP ke tabung reaksi dan tambahkan larutan α-naphthol dan KOH 40 %. Lalu hasil reaksi positif ditandai adanya warna merah muda eosin dalam waktu 2 jam.

Kemudian uji biokimia dengan uji IMViC - Uji Methyl Red (MR) dilakukan dengan mengambil biakan dari media PCA lalu inokulasikan ke tabung yang berisi media MR-VP dan inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 48 jam ± 2 jam. Kemudian tambahkan indikator MR pada tabung, dan hasil uji positif ditandai adanya warna merah dan hasil reaksi negatif ditandai adanya warna kuning.

Selain itu, uji biokimia dengan uji IMViC - Uji citrate dilakukan dengan menginokulasikan koloni dari media agar miring PCA ke dalam media Koser Citrate Broth (KCB), dan inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 96 jam, dan hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya kekeruhan pada media.

Interpretasi hasil pengujian biokimia dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.

Gambar 2. Interpretasi Hasil Pengujian Biokimia

4. Pengujian jumlah Staphylococcus aureus

Metode yang digunakan dalam pengujian jumlah Staphylococcus aureus yaitu dengan menghitung cawan secara sebar pada permukaan media.

Langkah-langkah pengujian jumlah Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut:

• Pengujian selalu disertai dengan menggunakan kontrol positif. Pengenceran dilakukan seperti pada pengujian sebelumnya. Namun, untuk contoh susu cair dimulai dari pengenceran 10⁰ ,sedangkan untuk sampel susu (padat dan semi padat) mulai pengenceran 10¹.
• Kemudian tuang ke media BPA yang sudah ditambah dengan egg yolk tellurite emulsion. Lalu pipet suspensi dari setiap pengenceran, dan diinokulasikan masing-masing pada cawan petri yang berisi media. Setelah itu, inkubasikan pada temperatur 35 °C selama 45 jam sampai dengan 48 jam.
• Lalu pilih cawan petri yang mengandung jumlah koloni 20 sampai dengan 200. Apabila cawan petri pada pengenceran terendah berisi < 20 koloni dan atau > 200 koloni, maka lanjutkan penghitungan koloni pada cawan petri dengan pengenceran yang lebih tinggi.
• Koloni S. aureus mempunyai ciri khas bundar, licin dan halus, cembung, diameter 2 mm sampai dengan 3 mm, berwarna abu-abu sampai hitam pekat, dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang terang (clear zone). Tepi koloni putih dan dikelilingi daerah yang terang. Catat jumlah masing-masing koloni yang mempunyai ciri tersebut.
• Ambil satu atau lebih koloni dari masing-masing bentuk yang tumbuh dan lakukan uji identifikasi.
• Uji identifikasi - Pengecatan Gram: Hasil Pengecatan gram akan terlihat bakteri berbentuk kokus berwarna ungu (Gram positif), bergerombol seperti anggur atau terlihat hanya satu bakteri.
• Uji identifikasi - Uji koagulase: Ambil satu atau lebih koloni yang diduga S. aureus dan masukkan ke dalam Brain Heart Infusion Broth (BHIB) dan homogenkan. Kemudian inkubasikan BHIB dan agar miring Tryptone Soya Agar (TSA) pada temperatur 35 °C selama 18 -24 jam. Lalu tambahkan koagulase plasma kelinci (coagulase rabbit plasma) yang mengandung Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) ke dalam suspensi BHIB yang telah diinkubasi kemudian homogenkan. Setelah itu, inkubasikan tabung pada temperatur 35 °C selama 6 jam dan amati setiap jam terhadap pembentukan gumpalan. Hasil uji koagulase positif S. aureus ditandai dengan adanya penggumpalan.
• Setelah itu, hitung koloni-koloni dari cawan petri yang menunjukkan koloni khas S. aureus dan menunjukkan hasil uji koagulase positif, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dilaporkan sebagai jumlah S. aureus per mililiter atau per gram.

5. Pengujian Salmonella spp.

Pertumbuhan Salmonella pada media selektif dengan pra pengayaan (pre-enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi.

Pengujian Salmonella spp. adalah sebagai berikut:

• Pra-pengayaan: Pra-pengayaan dilakukan dengan menambahkan larutan Lactose Broth (LB) dan diinkubasikan pada temperatur 35 ⁰C selama 24 jam ± 2 jam.
• Pengayaan: Biakan pra-pengayaan dipindahkan ke dalam media Tetra Thionate Broth (TTB) dan Rappapport Vassiliadis (RV). Untuk pengayaan pada media TTB, diinkubasikan pada temperatur 35 °C ± 2 °C selama 24 jam ± 2 jam. Sedangkan pengayaan pada media RV, diinkubasikan pada temperatur 42 °C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam.
• Isolasi dan identifikasi: setelah diinkubasikan, koloni Salmonella spp. diambil dan diinokulasikan pada media Hektoen Enteric Agar (HEA), Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA) dan Bismuth Sulfite Agar (BSA). Selanjutnya diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam. Amati koloni Salmonella pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H₂S). Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam. Untuk media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. Kemudian lakukan identifikasi dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut. Inokulasikan ke Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA) dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya digores pada media agar miring. Selanjutnya diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam.
• Uji biokimia dilakukan dengan uji urease, uji indole, uji Voges-Proskauer (VP), uji Methyl Red (MR), uji citrate, uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB), uji Kalium Cyanida (KCN), dan uji gula-gula; yang terdiri atas uji Phenol red dulcitol broth atau purple broth base dengan 0,5 % dulcitol, uji malonate broth, uji phenol red lactose broth, dan uji phenol red sucrose broth.
• Kemudian Uji serologis: uji serologis terdiri atas uji polyvalent somatic (O) dan uji polyvalent flagelar (H).

 

 6. Pengujian Campylobacter spp.

Pertumbuhan Campylobacter pada media selektif melalui tahapan pra-pengayaan, pengayaan, isolasi dan identifikasi serta konfirmasi.

Langkah-langkah pengujian Campylobacter spp. adalah sebagai berikut.

• Penyiapan sampel: Ukur sampel kemudian disentrifus dingin 20.000 rpm selama 40 menit, kemudian disaring dan dibuang supernatannya. Pindahkan endapan ke dalam botol sentrifus steril yang berisi enrichment broth (Bolton broth base ditambah lysed horse blood, ditambah juga Bolton antibiotik).
• Pra pengayaan (metode modifikasi Park dan Humphrey) dilakukan dengan menginkubasikan suspensi pada temperatur 37 °C selama 4 jam dalam kondisi mikroaerobik dengan Gas Tank System.
• Setelah itu, dilakukan pengayaan dengan menaikkan temperatur inkubasi suspensi menjadi 42 °C selama 23 jam sampai dengan 24 jam, dan 48 jam.
• Selanjutnya dilakukan isolasi, yang mana suspensi dibuat pengenceran dengan dimasukkan ke dalam pepton 0,1 %. Goreskan masing-masing suspensi pada media agar AHB atau modified Charcoal-Cefoperazone-Deoxycholate Agar (mCCDA). Inkubasikan pada temperatur 42 °C selama 24 jam sampai dengan 48 jam dalam Gas Tank System. Amati pertumbuhan pada inkubasi 24 jam.
• Identifikasi: Koloni berbentuk bulat atau tidak beraturan dengan tepi halus dan berwarna putih translusen dengan pertumbuhan menyebar. Pilih minimal 1 koloni dari tiap cawan petri dan siapkan pada gelas obyek. Lihat bentuk sel bakteri dibawah mikroskop dengan minyak emersi. Sel Campylobacter terlihat berbentuk koma atau melengkung, panjang 1,5 – 5 μm dan dengan formasi zigzag. Campylobacter umumya motil dan 20 % C. jejuni adalah tidak motil. Sel yang sudah tua dan cedera (injured) akan mengalami penurunan motilitas dan terjadi perubahan bentuk menjadi bulat. Pengujian selalu disertai dengan kontrol positif.
• Konfirmasi dan uji biokimia: Meliputi uji katalase, uji sensitifitas antibiotik, pengecatan Gram, uji hippurate hydrolysis, uji dengan TSIA, uji glucose utilization, uji katalase-oxidase, uji growth temperature tolerance, uji pertumbuhan pada MacConkey Agar, dan uji pertumbuhan (yang terdiri dari uji pertumbuhan pada glycine 1 %, uji pertumbuhan pada NaCl 3,5 %, uji H₂S dari cysteine, dan reduksi nitrat).

 

7. Pengujian Listeria monocytogenes

Metode pengujian ini didasarkan pada isolasi dan identifikasi bakteri Listeria monocytogenes dengan cara pembiakan pada media selektif.

Langkah-langkah Pengujian Listeria monocytogenes adalah sebagai berikut:

• Ditambahkan Buffered Listeria Enrichment Broth ke dalam kantong atau wadah steril yang berisi sampel, homogenkan.
• Dilakukan pra pengayaan dengan menginkubasi suspensi  pada temperatur 30 °C selama 4 jam.
• Dilanjutkan dengan pengayaan dengan cara suspensi diinkubasi sampai dengan 48 jam dengan menambahkan antibiotik Cycloheximide atau Natamycine. Setelah diinkubasikan, masing-masing dgoreskan 1 ose suspensi pada OXA atau PALCAM atau MOX atau LPM. Lalu inkubasikan media OXA, PALCAM, dan MOX pada temperatur 35 °C selama 24 jam sampai dengan 48 jam, sedangkan media LPM diinkubasikan pada temperatur 30 °C selama 24 jam sampai dengan 48 jam. Pada media LPM koloni Listeria terlihat berwarna abu-abu kebiruan atau putih. Pada OXA dan PALCAM koloni berwarna hitam dikelilingi zona jernih. Pada agar darah domba/kuda bakteri L. monocytogenes, tampak cekung dibagian tengahnya, berwarna abu-abu kebiruan, dikelilingi zona jernih (karena adanya sifat hemolisa dari L. monocytogenes)
• Kemudian dilakukan identifikasi dengan uji pengecatan gram, uji motilitas, uji gula-gula, uji katalase, dan uji konfirmasi dengan CAMP test.

Interpretasi hasil uji L. monocytogenes dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah ini:

Tabel 1. Interpretasi Hasil Uji L. monocytogenes

Alat atau instrument apa saja yang dibutuhkan dalam pengujian mikroba pada dairy product?

Pengujian mikroba pada dairy product yang sesuai dengan metode dalam SNI, dibutuhkan alat yang tepat. Adapun alat atau instrument yang umumnya digunakan pada pengujian mikroba pada dairy product dalam menunjang metode pengujian yang telah dipaparkan diatas adalah sebagai berikut.

1. Neraca analitik

Timbangan Analitik seperti Kern ABS 220 – 4N; ABS 320-4N; ABJ 320-4NM; ABJ 220-4NM dapat digunakan untuk menimbang bahan-bahan yang akan digunakan dalm pengujian Salmonella secara akurat.

Gambar 1. ABS 220 – 4N

 

2. Pipet

Pipet 1 channel HIRSCHMANN-94775404 Labopette digital dengan pengaturan volume variable 1-10 ml dapat digunakan untuk pengambilan bahan-bahan pengujian berupa cairan secara akurat sesuai dengan variabel volume yang dibutuhkan pada saat pengujian.

Gambar 2. HIRSCHMANN-94775404

 

3. Inkubator

Inkubator Memmert tersedia dalam berbagai ukuran. salah satu tipe yang dapat dipakai pada pengujian Salmonella adalah IN30 Inkubator. IN30 Incubator adalah inkubator dari Memmert yang memiliki volume sebesar 32 L. Instrumen ini memiliki model tampilan SingleDisplay dan tipe sirkulasi udara Natural air circulation (Convection).  Pengaturan kisaran suhu pada inkubator Memmert adalah +20 hingga +80 ⁰C. Inkubator Memmert pada pengujian Salmonella pada yogurt digunakan untuk menginkubasi (menumbuhkan) mikroorganisme pada sampel yogurt untuk suhu 35 ⁰C dan selanjutnya dapat dilakukan pengujian lanjutan.

Gambar 3. IN30 Inkubator

 

 4. Oven

Oven Universal Memmert tersedia dalam berbagai ukuran yang dapat digunakan untuk mensterilisasikan alat-alat pengujian sebelum digunakan ataupun setelah digunakan, antara lain cawan petri, labu Erlenmeyer, dan pipet.

Gambar 4. Oven Memmert

 

5. Waterbath

Waterbath basic WNB Memmert dapat digunakan untuk menginkubasi sampel uji pada media pengkayaan TT broth pada (35 ± 2,0) ⁰C selama (24 ± 2 jam).

Gambar 5. Waterbath basic WNB Memmert

 

6. Autoklaf

Autoklaf Hirayama atau All American untuk pengujian Salmonella pada yogurt digunakan untuk sterilisasi alat ataupun bahan/media yang akan digunakan pada pengujian.

Gambar 6. Autoclave Hirayama

 

7. Kertas pH

Kertas pH digunakan untuk mengukur pH pada saat pra-pengkayaan sampel yogurt.

8. Pipet tetes

9. Botol pengencer 1000 ml

Botol pengencer digunakan sebagai wadah pengenceran untuk menghomogenkan sampel yogurt untuk pra-pengkayaan.

10. Tabung reaksi

Tabung reaksi digunakan pada pengujian sebagai tempat pengenceran atau penyimpanan media.

11. Gelas ukur 10 ml

12. Cawan petri

Cawan petri pada pengujian digunakan antara lain untuk tempat menimbang bahan, tempat menumbuhkan sampel uji,

13. Gelas sediaan

14. Pengaduk gelas

15. Jarum inokulasi

Jarum inokulai atau jarum ose biasanya digunakan untuk melakukan inokulasi sampel uji.

16. Pensil lilin

17. Bunsen

Bunsen pada pengujian digunakan untuk sterilisasi jarum ose sebelum inokulasi sampel, dan mengkondisikan area dalam kondisi aseptis.

 

Referensi :

[1] Badan Standardisasi Nasional. 2009. Standar Nasional Indonesia 2981:2010 “Yogurt”. Badan Standardisasi Nasional